Identificación genética de hongos (actualizada el 25/4/2005)

Pronunciada por Dª. Mª Jesús Iturralde de la Sociedad Micológica de Madrid.

El Prof. Calonge presentó a Mª Jesús como perteneciente al Instituto de Toxicología y Ciencias Forenses, Departamento de Madrid: Servicio de Biología, aunque es de sobra conocida por su experiencia en el dificil terreno de la identificación de setas por sus genes.

Inició su exposición situando el Instituto dentro de las actividades de las Ciencias Forenses para ayudar en la investigación biológica de la paternidad incluso con el padre fallecido, en identificación de restos humanos, víctimas de terrorismo, vestigios biológicos y en el caso concreto donde es necesario identificar hongos.

Los métodos moleculares son la última palabra en la identificación de setas. La aplicación de las diferentes metodologías de análisis del ADN (Ácido DesoxirriboNucleico) diseñadas y probadas en los últimos años, todas ellas basadas en la Técnica de Amplificación génica (PCR), están permitiendo conocer el genoma de los hongos.

Los apartados principales de la presentación fueron:

• Estructura y función del material genético.
  El ADN (Ácido desoxirribonucleico) es la molécula portadora de la información genética.
  Se trata de una larga molécula de cadena doble compuesta de una unidad química, el nucleótido que se repiten a lo largo de la cadena. Cada nucleótidoestá constituido por una base nitrogenada [Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C), Timina (T)], una molécula de azúcar (desoxirribosa) y una de ácido fosfórico.
  Las bases, (A, G, C, y T) son las letras del código genético cuya ordenación a lo largo de la cadena de ADN será la que determine la información genética.
  
  

• El genoma de las setas. Es el tipico de las células eucariotas, localizados tanto en el núcleo como en las mitocondrias. Los cromosomas contienen miles de secuencias. Estas se organizan en genes (secuencias codificantes) que están interrumpidos por secuencias no codificantes. Algunas secuencias son únicas pero otras pueden estar repetidas muchas veces.
  La identificación con ADN se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en las diferentes especies pero que poseen la característica de ser variables o polimórficos entre ellas.
  
  

• Región del ADN nuclear de hongos más utilizados en la identificación genética: Las regiones de ADN mitocondrial y nuclear que tienen un mayor interés tanto en estudios de filogenia como en taxonomía de hongos, son las que codifican para el ARN ribosómico (rADN). El rADN mitocondrial consta de dos genes, 16S y 23S, que se repiten espaciados a lo largo de su genoma. Por el contrario el rADN nuclear tiene muchas copias, desde 60 en el género Coprinus hasta 220 en Neurospora, que se repiten en tándem y se trata de un sistema complejo que incluye los genes 18S, 28S y 5.8S ARNr. Las secuencias de estos genes están separadas por dos espaciadores internos que se transcriben, llamados ITS-1 e ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) de una longitud entre 200 y 400 bases. Entre estos genes hay un espaciador intergénico que no transcribe, llamado IGS (non-transcribed intergenic spacer). Las zonas no codificantes del rADN nuclear (ITS-1, ITS-2 e IGS) son más susceptibles de acumular mutaciones y por lo tanto tienen gran interés en el estudio de la identificación y tipificación de especies fúngicas. El diseño de cebadores universales dentro de las zonas altamente conservadas de los genes rARN para PCR ha permitido amplificar las regiones ITS-1, ITS-2 e IGS en un amplio rango de organismos. Además de las regiones de rADN se conocen otros fragmentos del ADN con interés en la identificación:

  • gen de la Beta-tubulina
  • gen de la Orotidina descarboxilasa
  • gen de la Chitina sintetasa
  • gen de la Actina
  • gen de la Factor de elongación
  
  

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
  Ideada por Kary B. Mullis (1985) permite multiplicar in vitro una región específica del ADN más de un millón de veces. Es un método automatizado de síntesis enzimática in vitro de secuencias de ADN. La especificidad de la reacción se consigue usando un par de pequeños fragmentos de ADN (de 15 a 30 bases) que son complementarios a las secuencias que flanquean al segmento de ADN que se desea amplificar y que actuarán como iniciadores o cebadores.
  
  Componentes de la reacción PCR: el ADN molde, dos cebadores o primers, el enzima ADN polimerasa y desoxinucleótidos trifosfato (dNTP). La cantidad de ADN molde necesaria es de nanogramos o menos.
  
  Método: la reacción consiste en la repetición de un ciclo de tres etapas, cada una de las cuales se realiza a una temperatura determinada. En la primera etapa (desnaturalización) entre 92-95ºC, la doble cadena de ADN se desnaturaliza. En la segunda etapa (anillamiento) se reduce la temperatura para permitir que los cebadores o primers se unan a las secuencias homólogas del ADN monocatenario y, en la tercera etapa (extensión), tiene lugar la síntesis de la región que flanquean los cebadores gracias al ajuste de la temperatura óptima del enzima ADN polimerasa que se utilice. La repetición secuencial de este ciclo de tres etapas da como resultado la acumulación exponencial del fragmento de ADN que se desea amplificar.
  
  

• Buenas prácticas de laboratorio: son fundamentales para evitar la contaminación de la muestra con ADN exógeno y de esta manera garantizar la calidad y repetibilidad de los resultados: por ello se requiere vestimenta adecuada, separación de laboratorios PRE-PCR y POST-PCR, superficies limpias y tratadas con UV, usar materiales estériles y desechables, control negativo en el proceso de extracción y negativo y positivo en el de amplificación.
  
  

• Métodos de análisis del polimorfismo del ADN basados en la PCR una vez amplificado el fragmento de ADN, los fragmentos resultantes pueden ser caracterizados de diferentes maneras. Las técnicas más utilizadas en micología son:
  
  

  • PCR/RAPD: análisis del ADN amplificado al azar. Se parte del genoma entero y se utilizan diferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPD para cada especie.
    
    

  • PCR/RFLP: análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción: esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie de fragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón de bandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificada mediante el uso de enzimas de restricción.
    Comentarios: técnicas rápidas y económicas pero dan patrones difíciles de interpretar y difícilmente reproducibles.
    
    

  • PCR/SSCA: análisis conformacionales del ADN de una sola cadena. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas de ADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad, de tal manera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base migrarán de forma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se realiza una separación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El patrón de bandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Al igual que ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre reproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a la secuenciación.
    
    

  • PCR/Secuenciación: la técnica más utilizada es la secuenciación cíclica con terminadores de cadena marcados con fluorocromos. Las secuencias de nucleótidos que se obtienen para la región diana en cada organismo y en diferentes laboratorios pueden ser comparadas y publicadas en bases de datos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc) y de esta manera se facilita la comparación entre ellas y con las de otros taxones.
    
    

  Datos moleculares: problemas: las secuencias generadas en diferentes investigaciones normalmente se publican y se depositan en los bancos de datos de secuencias. Un problema es que en muchos casos, los datos de secuencias se depositan sin haber completado el estudio taxonómico o antes de que sea aceptada la publicación. Los nombres adjuntos a las secuencias los dan los depositarios de las mismas y es probable que no todos utilicen la misma nomenclatura. A veces se puede partir de material de herbario que no esté identificado correctamente, sin olvidar que puede haber una contaminación en el laboratorio debido a una mala praxis. Todas estas situaciones, pueden dar lugar a que existan secuencias erróneas en las bases de datos públicas. Para evitar estos inconvenientes pensamos que es necesario disponer de bases de datos propias cuidadosamente generadas.
  
  

• Estudio que se realiza en el Servicio de Biología:
  • Se trata de secuenciar las regiones ITS-1 e ITS-2 a partir de especies tóxicas del género Amanita.
  • Estudiar la variabilidad que presentan estas regiones.
  • Comprobar si la diversidad de estas regiones permite establecer una adecuada discriminación de especie.
  • Realizar Bases de Datos de secuencias nucleotídicas de ambas regiones. Si la variabilidad de estas regiones es apta, en un futuro se trataría de desarrollar un test de identificación robusto y más rápido que la técnica de secuenciación para estas especies tóxicas en muestras forenses.

Finalmente agradeció a todos los que colaboran con ella en el Instituto en el trabajo día a día y a Mª Paz Martín investigadora del Consejo Superior de Investigaciones Científicas del Real Jardín Botánico de Madrid que es la directora de la tesis que está preparando.

El presidente le entregó el libro sobre los bosques españoles, que habia merecido por su charla.

En la sección de preguntas empezaron sobre cómo se utiliza la genética para la identificación de especies. Es un tema muy trabajado en la actualidad. La investigación se basa en estudiar la variabilidad de las diferentes regiones polimórficas del ADN entre las especies pertenecientes a un determinado género y de esta forma establecer cuales son las regiones más adecuadas para la identificación genética.

Sobre el tiempo que necesitan los experimentos comentó que un ciclo de extracción, amplificación por PCR, secuenciación y análisis final puede requerir una semana para procesar unas 30 muestras simultáneamente. El coste no es muy elevado si se cuenta con la infraestructura adecuada: laboratorio Pre-PCR y Post PCR, campanas de flujo laminar, termocicladores, secuenciadores etc. y personal altamente cualificado.

Un tema espinoso parece ser el conseguir muestras de ejemplares tipo citados en la literatura y almacenados en herbarios. El Botánico sí proporciona muestra pero otros herbarios famosos en Micologia no lo hacen.